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分子病理實驗室

病理學前沿

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<img src="http://proec57c364.pic8.websiteonline.cn/upload/222.jpeg" width="2560" height="1920"/>一、區(qū)域劃分 按功能可分為：實驗區(qū)、準備區(qū)和辦公區(qū)。 01 實驗區(qū) 樣本接收區(qū)： 接收臨床送檢的體液及石蠟樣本，核對患者信息，對所接收的樣本進行登記編號，體液樣本置于4℃保存，及時處理。 樣本前處理區(qū)： 用于組織切片、脫蠟、染色及血液、尿液、胸腹水等標本的離心、涂片、染色等。體系突變檢測時，需對組織學或細胞學樣本進行病理質控，目的是進一步明確病變組織或細胞與病理診斷是否一致；評估腫瘤細胞的比例是否達到檢測要求；確定腫瘤細胞位置，富集腫瘤細胞，避免出血、壞死、間質細胞影響DNA質量。因該區(qū)域使用二甲苯等有毒有害物質，需設置通風櫥，做好化學安全防護，且配有廢液桶，廢棄的二甲苯等化學污染物統(tǒng)一回收處理。 試劑暫存及準備區(qū)： 試劑暫存區(qū)需配備4℃和-20℃以下冰箱，按照試劑儲存條件分別儲存，并記錄使用情況。準備區(qū)根據(jù)反應體系，配制各反應試劑。 樣本制備區(qū)： 石蠟樣本癌組織的富集、樣本的消化、DNA和ＲNA的提取及OD值的測定。該區(qū)域安置外排式二級生物安全柜，降低實驗過程中產(chǎn)生的有害氣溶膠對實驗人員和環(huán)境的危害。特別是用于檢測胚系突變的血液樣本和攜帶各種病毒的樣本，均需在生物安全柜內完成操作，做好生物安全防護。如有計劃開展通過超敏感的方法對血液中微量的循環(huán)DNA進行檢測的項目，本區(qū)域需獨立劃分用于提取微量循環(huán)DNA區(qū)域，防止其他樣本高濃度的DNA對微量循環(huán)DNA的污染。 核酸片段化區(qū)： 樣本核酸的打斷。該區(qū)域可能產(chǎn)生核酸氣溶膠，屬于核酸污染區(qū)，需要做好相應防護的清潔處理。 PCR擴增一區(qū)： 第1次PCR擴增。在PCR過程中可產(chǎn)生大量短片段的核酸，是核酸氣溶膠的重要來源。該區(qū)域屬于核酸污染區(qū)，需要盡量避免PCR反應時的爆管和PCR反應后開蓋，一旦發(fā)生要做好記錄并及時做好核酸污染的清潔處理，并監(jiān)測空氣中是否已經(jīng)存在氣溶膠。 產(chǎn)物分析區(qū)： 對PCR產(chǎn)物或打斷后的核酸進行電泳檢測。核酸片段化分為機械打斷和酶消化打斷，機械打斷后需要對產(chǎn)物進行電泳檢測，評估核酸片段化狀態(tài)。該區(qū)域存在核酸片段化后或PCR擴增后產(chǎn)物開蓋的操作，也是核酸氣溶膠重要來源的區(qū)域，屬于核酸污染區(qū)。 純化一區(qū)： 第1次PCR產(chǎn)物純化、第1次雜交、第1次捕獲、第2次雜交、第2次捕獲及捕獲樣本純化。該區(qū)域存在PCR擴增后產(chǎn)物開蓋的操作，是核酸氣溶膠重要來源的區(qū)域，屬于核酸污染區(qū)。 PCR擴增二區(qū)： 第2次PCR擴增。注意事項同PCR擴增一區(qū)。 純化二區(qū)： 第2次PCR產(chǎn)物純化及文庫檢測。注意事項同純化一區(qū)。 測序區(qū)： 放置測序儀，進行上機測序。該區(qū)域自身不產(chǎn)生核酸氣溶膠，但需要采取防止被氣溶膠污染的措施，屬于核酸半污染區(qū)。 數(shù)據(jù)分析區(qū)： 數(shù)據(jù)處理分析，結果解讀及報告打印。該區(qū)域自身不產(chǎn)生核酸氣溶膠，屬于核酸半污染區(qū)。此外，若建立熒光原位雜交技術檢測平臺，需獨立設置以下兩個區(qū)域： 熒光原位雜交區(qū)：此區(qū)域主要進行低滲、預固定、固定、滴片、老化、消化、洗片、變性、雜交、再洗片等工作，該區(qū)域處理可能攜帶生物危害物的血液、骨髓、尿液或其他體液，需配備生物安全柜或通風櫥，預防生物污染物對工作人員的傷害。 熒光原位雜交觀察區(qū)：避光、安置熒光顯微鏡，觀察結果。 2 實驗準備區(qū) 高溫滅菌室： 配備高壓蒸汽滅菌器和高溫烘箱，設備功率較高，需單獨線路配電。因高壓蒸汽設備，該區(qū)域空氣交換12次/h。 危險品倉庫： 該區(qū)域應遠離實驗室和辦公區(qū)，安全出口通暢。所有危險化學品必須存放到鐵柜中，對于有腐蝕性、易燃易爆性的試劑，采取防腐防爆和通風措施，且鐵柜上加裝掛鎖，鑰匙專人保管。危險品倉庫應配有滅火器和滅火沙桶，做好防火工作。 一般倉庫： 存放移液器吸頭、離心管等，緊貼墻壁安裝貨架，將各類耗材按序排放，便于取用。 試劑儲存間： 試劑儲存分為室溫儲存（18℃-26℃）、冷藏儲存（2℃-8℃）和冷凍儲存（-20℃以下），試劑儲存間的冰箱和冷凍柜產(chǎn)生大量的熱，需安裝通風系統(tǒng)，注意環(huán)境溫度的控制。冰箱和冷凍柜應裝配帶警示的溫度監(jiān)測系統(tǒng)，當溫度異常時發(fā)出警報，工作人員可及時處理，避免試劑失效。 3 辦公區(qū)該區(qū) 主要用于實驗人員工作、學習、休息場所，為潔凈區(qū)，需要遠離生物污染區(qū)和危險品倉庫。對于步驟多、流程長的檢測平臺，為防止污染，實驗室功能區(qū)設計盡量細分。如果實驗室有多個檢測技術平臺，根據(jù)使用儀器的功能，可適當合并功能區(qū)。筆者認為，實驗室的污染分為生物污染和核酸污染，生物污染主要是在處理體液樣本的區(qū)域，而核酸污染主要在核酸提取、擴增和分析的區(qū)域。據(jù)此，應將實驗室劃分為以生物污染對象的生物污染區(qū)、生物半污染區(qū)和生物潔凈區(qū)，也可以將實驗室劃分為以核酸污染對象的核酸污染區(qū)、核酸半污染區(qū)和核酸潔凈區(qū)。 二、氣流流向 PCR實驗室中容易產(chǎn)生核酸短片段形成的氣溶膠污染，氣溶膠是懸浮于氣體介質中的由粒徑為0.001μm～100μm的固態(tài)或液態(tài)微小粒子形成的相對穩(wěn)定的分散體系。一旦發(fā)生核酸氣溶膠污染，會直接導致核酸檢測結果出現(xiàn)錯誤，并且比較難以去除這種污染。為防止核酸氣溶膠污染，各功能區(qū)需安裝獨立的通風系統(tǒng)，密封，不得交叉通風，避免交叉污染。 對于實驗室通風，氣流宜采用上送下排方式，送風口和排風口布置應有利于室內可能被污染空氣的排出，在生物安全柜操作面或其他有氣溶膠產(chǎn)生的地點上方附近不應設置送風口。各區(qū)域空氣交換12次/h～16次/h。實驗室亦可采取窗戶進行自然通風，但需設防蟲紗窗和防節(jié)肢動物設施。有條件的實驗室可安裝負壓裝置，功能區(qū)內氣壓（負壓）與室外大氣壓的壓差值應＞30Pa，與相鄰區(qū)域的壓差（負壓）應＞10Pa。 三、緩沖區(qū)間 實驗功能區(qū)均需設置緩沖區(qū)間，控制空氣的流向，緩沖區(qū)間門具有互鎖功能，不能同時處于開啟狀態(tài)。緩沖區(qū)間內設置非手動開關的洗手裝置、衣架或衣柜，方便實驗人員進出換實驗服。不同功能區(qū)緩沖區(qū)間應使用不同顏色的工作服，工作人員離開各緩沖區(qū)間不得將工作服帶出。 四、應急設置 應在樣本前處理區(qū)和樣本制備區(qū)內安置緊急沖淋洗眼器及緊急淋浴裝置，便于緊急事故的處理。實驗室內應設置火災自動報警裝置和應急照明裝置，安全通道有消防疏散指示標志，并配備適用的應急器材，如消防器材、意外事故處理器材、急救器材等。 五、溫濕度控制 測序區(qū)、PCR擴增一區(qū)和二區(qū)等放置大型精密儀器的區(qū)域應恒溫恒濕，相對濕度宜控制在30%～70%范圍內。溫度宜控制在18℃～26℃范圍內，2h內溫度波動應＜2℃，避免環(huán)境因素影響實驗結果。 六、二級生物安全實驗室 二級生物安全實驗室的用電負荷不宜低于二級，大型重要精密設備需單獨線路配電，并配備不間斷電源（UPS），保證電源電壓的穩(wěn)定。另外，各功能區(qū)需安裝可定時的紫外燈，紫外燈發(fā)出波長為254nm的紫外線，可使長片段的核酸斷裂，即防止生物污染，又防止核酸污染。安裝在拋光天花板上的固定紫外燈距地面距離＜2.1m，紫外燈的數(shù)量由各區(qū)域空間決定，確保照射劑量＞9000uW·s/cm。

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